說到脂肪肝（Fatty liver disease, FLD），大家一定不陌生，每年體檢，被查出脂肪肝的大有人在，但由于脂肪肝初期并沒有明顯的癥狀，很多人對此并不重視，還是該吃吃該喝喝，等到進(jìn)展成肝炎、肝癌了才追悔莫及。

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脂肪肝是由于多種原因引起的肝臟細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積過多（主要是由甘油三酯 ，TG）而產(chǎn)生的常見肝臟病變，已成為全球肝損傷的主要原因。

脂肪肝進(jìn)展到晚期可導(dǎo)致肝硬化和肝細(xì)胞癌，對公共健康造成重大威脅，目前還沒有藥物被批準(zhǔn)用于治療 FLD，因此，迫切需要開發(fā)新的藥物靶點(diǎn)和有效療法。

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2024年1月31日，一篇發(fā)表在?PNAS?題為?The ubiquitin E3 ligase BFAR promotes degradation of PNPLA3?的研究論文引起廣泛關(guān)注，該文研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)泛素 E3 連接酶 BFAR ，可以促進(jìn) FLD 的重要遺傳危險(xiǎn)因素 PNPLA3 的降解，為 FLD 治療提供了新靶點(diǎn)。

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實(shí)驗(yàn)中，研究團(tuán)隊(duì)首先鑒定并確認(rèn)了細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子 BFAR 作為 PNPLA3 的 E3 泛素連接酶，可以發(fā)揮對 PNPLA3 的調(diào)節(jié)作用。

而后，使用 siRNA 敲除了穩(wěn)定表達(dá) PNPLA3 的 HuH7 細(xì)胞中的 BFAR，發(fā)現(xiàn)處理后細(xì)胞 PNPLA3 蛋白水平提高了 2.8 倍。通過解析 BFAR 的重組形式，并使用 CRISPR-Cas9 技術(shù)生成 BFAR 表達(dá)失活的細(xì)胞系，通過 Sanger 測序確認(rèn)失活突變。

結(jié)果表明 ，在 BFAR 失活的細(xì)胞中，PNPLA3-HiBiT（用于檢測和追蹤PNPLA3水平的融合蛋白）的水平增加了 5 倍至 20 倍，說明?BFAR 的耗竭可以增加培養(yǎng)的肝細(xì)胞中的 PNPLA3 水平。

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?▲肝細(xì)胞中 BFAR 的結(jié)構(gòu)域組織、結(jié)構(gòu)模型和BFAR失活

進(jìn)一步的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)也顯示，BFAR?的過表達(dá)可以降低培養(yǎng)肝細(xì)胞中?PNPLA3?蛋白水平。此外，通過使用重組 PNPLA3 和 BFAR 進(jìn)行的下拉試驗(yàn)，顯示這兩種蛋白之間存在相互作用，并在細(xì)胞中觀察到它們的免疫共沉淀作用。

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為了測試 BFAR 是否可以泛素化 PNPLA3，研究團(tuán)隊(duì)使用重組蛋白進(jìn)行了體外測定證實(shí)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，體外測定發(fā)現(xiàn)?BFAR 可以作為 E3 泛素連接酶用于 PNPLA3 的單泛素化；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中敲除 BFAR 不會(huì)導(dǎo)致 PNPLA3 泛素化減少，但細(xì)胞中 PNPLA3 有增加的趨勢。

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▲BFAR 對 PNPLA3 的泛素化

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研究人員還通過 CRISPR-Cas9 技術(shù)構(gòu)建了 Bfar^?/?鼠，與? WT 小鼠進(jìn)行免疫印跡對照實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) Bfar^?/?小鼠肝臟中 PNPLA3 水平高出 WT 小鼠 2 倍。然而，盡管高水平的 PNPLA3 蛋白在脂滴上的積累與肝臟 TG 的增加相關(guān)，但在 Bfar 基因敲除小鼠中未觀察到肝臟 TG 的增加。這表明 PNPLA3 的積累可能與肝臟 TG 水平的變化有關(guān)，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)肝臟 BFAR 水平不會(huì)因小鼠食物攝入量而變化。

在 WT 小鼠中，蔗糖喂養(yǎng)可增加 PNPLA3 mRNA 和蛋白的水平。為了確定 BFAR 表達(dá)是否也受到喂養(yǎng)的調(diào)節(jié)，團(tuán)隊(duì)測量了禁食小鼠肝臟中 BFAR 蛋白和 mRNA 的水平，發(fā)現(xiàn)在禁食和喂食小鼠肝臟中 BFAR 蛋白水平無差異。

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小結(jié)

綜上，這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，PNPLA3的突變形式在脂滴上積累，干擾肝臟三酰甘油的積累 ，從而促使脂肪肝病的發(fā)展。BFAR作為一個(gè)E3泛素連接酶，通過促進(jìn)PNPLA3的降解來調(diào)節(jié)其水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BFAR的失活導(dǎo)致PNPLA3水平增加，而BFAR的過表達(dá)則降低PNPLA3水平。這些發(fā)現(xiàn)揭示了BFAR在調(diào)控肝細(xì)胞中PNPLA3水平的作用機(jī)制，為治療FLD的研究提供了新思路。

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參考資料：

[1] Das A, Cheng H, Wang Y, Kinch LN, Liang G, Hong S, Hobbs HH, Cohen JC. The ubiquitin E3 ligase BFAR promotes degradation of PNPLA3. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024 Feb 6;121(6):e2312291121. doi: 10.1073/pnas.2312291121. Epub 2024 Jan 31. PMID: 38294943; PMCID: PMC10861911.

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